脓汁和粪便标本中病原菌的检测
08XXXXX XX（学号：XXXXXXX）
摘要：取脓汁标本通过划线分离与培养，得到不同菌株，再通过菌落群体生长特征观察、细菌的个体形态特征、生化试验、药敏试验；结论：脓汁标本中金黄色菌落为金黄色葡萄球菌，白色菌落为白色葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌为致病菌，金黄色葡萄球菌对青霉素敏感，庆大霉素对G+和G-菌都敏感。
关键词：脓汁、黄色菌落、白色菌落、检查
Specimen of sepsis juice pathogenic test
XXXXXX(student id:XXXXXXXX)
Abstract: Take pus juice specimens and training, crossed through different strains colony, through the observation, the bacteria growth characteristics of morphology, individual biochemical tests, antimicrobial susceptibility test, Conclusion: sepsis juice specimens for golden staphylococcus aureus, bacterial colonies for white white staphylococcus aureus, including staphylococcus aureus, for pathogens of penicillin sensitive to G +, gentamicin and G – all sensitive bacteria.
Keywords: Pus juice, yellow colonies, white colonies, check the colony
从临床采集的标本中分离并鉴定细菌的目的是为了查找与疾病有关的病原菌，才能有效地采取措施，这对于临床治疗及预防都是很有价值的。细菌往往有独特的形态特征及生化反应特征，基于这两项，即可通过相应的观察方法以及生化试验鉴别出细菌的种类。在临床上，治疗细菌感染，往往需要通过药敏试验，找出敏感药物并对症下药才能达到有效地治疗效果，亦有避免细菌耐药性产生的作用，后者对由于细菌感染引起的疾病的控制与预防有着重大意义。
1 实验器材与方法
1.1.1 实验器材 接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、奥林巴斯 CX21型 生物显微镜、1500W电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子。
1.1.2 实验材料 脓汁标本，琼脂培养基，干粉培养基，营养琼脂和营养肉汤，青霉素、链霉素、庆大霉素。
1.2 方法
1.2.1 培养基的制备
表1
| 组号 | 培养基 | 称量(g) | 水量(ml) | 煮沸(次) | 分装(ml) | 备注（40人份） |
| 1 | 营养琼脂 | 11.4 | 300 | 4瓶，500ml瓶，平板 | ||
| 2～4 | 营养琼脂 | 2.9 | 75 | 3 | 5 | 15支，中试管，斜面 |
| 5～7 | 营养肉汤 | 1.1 | 55 | 1 | 3 | 15支，小试管，液体 |
| 8～10 | 半固体 | 1.5 | 55 | 3 | 5 | 15支，小试管，高层 |
按照表1要求称取培养基、煮沸、分装。
分装完毕后，套上棉塞，用牛皮纸包装，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。然后放入压力蒸汽灭菌器用高压蒸汽灭菌。
接下来按如下步骤进行：
营养琼脂平板：灭菌后冷却至50~60℃（以防冷凝水太多）时，在无菌操作下倾入已灭菌的平皿中10ml制成平板，待冷却至室温的时将平板倒放，4℃冰箱保存备用。
营养琼脂斜面：培养基趁热斜放，培养基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后（温度降至室温），4℃冰箱保存备用。
营养肉汤及半固体培养基：灭菌后可直接使用。
1.2.2 细菌的分离与培养
采用平板划线分离法，将取脓汁和粪便标本中混杂的多种细菌，分别在普通平板和伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。
细菌群体生长特征的观察。观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、色素。
细菌的纯培养。脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落；粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。挑选这四种不同菌落分别在斜面培养基上接种，标记，在37℃培养18h。
1.2.3 细菌个体形态的观察
按照甲、乙涂黄色、紫黑；丙，丁涂白色、粉红分工进行实验如下：
取载玻片一张，加生理盐水3～4ul，2滴。
用接种环取菌苔少许（1mm小菌落的半量）与盐水混匀，涂成1cm2。
涂毕，环移至涂膜中央侧立，使菌膜破裂,最后接种环灭菌并干燥玻片。
按图1所示，进行革兰氏染色。染色完毕后于显微镜下观察。
图1
肉汤接种方法 按照甲接种黄色菌落、乙接种白色聚落、丙接种紫黑色菌落、丁接种粉红菌落分工接种液体培养基，35℃培养4～6小时。
1.2.4 细菌生化反应鉴定
血浆凝固酶试验 取二滴兔血浆置于洁净的玻片上，分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。出现明显凝块为阳性，否则为阴性。
1.2.5 细菌的糖发酵试验
按照“甲,乙→紫黑→①葡萄糖,②乳糖；丙,丁→粉红→③葡萄糖,④乳糖”方式用接种针分别接种菌落至糖发酵管中。观察细菌对糖的分解情况。
1.2.5 细菌的药物敏感性试验
接种环取菌液3～6ul×2环，在琼脂平板上画一十字，平板密集划线接种细菌（纱窗样）。
设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。
37℃18～24小时培养，观察结果。结果如图2、图3所示
图2 图3
其中图2为白色菌落药敏试验结果，图3为黄色菌落药敏试验结果
2 结果
2.1平板菌落特征
2.1.1普通平板菌落特征 可见黄色菌落、白色菌落,且1区菌落密集难以分辨，至4区和5区已经形成单个菌落。如下图5。
图5
2.1.2伊红美蓝平板上的菌落特征可见紫黑色、粉红色菌落。如下图6。
图6
2.2 固体培养基特征
从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。图7是正面观察，图8是背面观察。
图7 图8
2.3 革兰氏染色镜检结果
黄色、白色菌呈葡萄状排列，染色为紫色（图9），为革兰氏阳性菌，粉红色、紫黑色菌呈杆状，染色为粉红色，为革兰氏阴性菌（图10）。
图9 图10
2.4 血浆凝固酶试验结果
白色菌落结果为阳性（图11下），黄色菌落结果为阴性（图11上）。
图11
2.5 糖发酵实验结果
2.5.1 紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵罐中皆变色和产生气泡，说明紫黑色细菌均能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气。
2.5.2 粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡，说明其能分解葡萄糖，产酸不产气；在乳糖发酵罐中既不变色又不产生气泡，说明其不能分解乳糖，不产酸不产气。
2.6 药敏试验结果
药敏试验，结果如图12、图13，左边为脓汁白色菌落标本，右边为脓汁黄色菌落标本。可见脓汁标本对三种抗生素均敏感，详细见表2。
图12 图13
表2药敏实验结果
| 菌落 | 青霉素 | 链霉素 | 庆大霉素 |
| 黄色细菌白色细菌紫黑细菌
粉红细菌 |
49mm +35mm +10mm –
14mm – |
26mm +26mm +21mm +
18mm + |
28mm +29mm +25mm +
22mm + |
说明：耐药－，中度敏感±，敏感＋
2.7 最后的检测结果
脓汁标本分离出来的黄色菌为金黄色葡萄球，白色菌为白色葡萄球菌。粪便标本中分离出来的紫黑色菌为大肠埃希菌，粉红色菌为福氏志贺菌。
3 讨论
3.1 采用平板划线分离法，从脓汁标本中分离出了黄色和白色两种菌落。经革兰染色后并显微镜观察下，发现这两株细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；结合菌落颜色，可以判定这两株葡萄球菌分别是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。再通过血浆凝固酶试验鉴别，可以发现金黄色葡萄球菌是致病菌。
通过对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌进行药敏试验，发现该两种G+菌均对青霉素敏感，通过与其他小组的数据比较显示，G-的痢疾杆菌对链霉素敏感；庆大霉素对G+和G-菌都敏感庆大霉素对G+和G-菌都敏感。
3.2 用伊红美蓝平板培养的菌落，可以分离出紫黑色具有金属光泽的菌落和粉红色半透明菌落；用革兰氏染色法染色，这两种菌均为G﹣杆菌，形状为杆状，排列紊乱；经糖发酵试验，可以观察到，紫黑色菌使能使葡萄糖和乳糖的试管产酸产气，粉红色菌只能使葡萄糖的试管产酸而不产气，对乳糖则无反应；在半固体培养基上培养，可以观察到紫黑色菌在半固体培养基中扩散，成浑浊状态，粉红色菌成一条直线，综上所述，紫黑色菌为大肠埃希菌，粉红色的为痢疾志贺菌：最后进行药敏试验，得出结论：大肠埃希菌和痢疾志贺菌对青霉素不敏感，对庆大霉素和链霉素都敏感。
3.3 实验中，乙同学接种的白色菌落，第一次革兰氏染色结果为阴性。怀疑为使用95%的乙醇脱色时间太长，第二次脱色时间缩短后，革兰氏染色镜检结果为阳性，证实了先前的判断。
3.4 在制作革兰氏染色玻片过程中，开始时候挑取的菌落比较多，导致后期观察时，细菌重叠，无法清楚观察细菌的形态。
参考文献
[1]贾文祥.医学微生物学(八年制规划教材).北京:人民卫生出版社,2005
[2]管远志,王艾琳,李坚.医学微生物学实验技术.北京:化学工业出版社,2006
[3]黄秀梨.微生物学实验指导.北京:高等教育出版社,2004
[4]闻玉梅.现代医学微生物学.上海:上海医科大学出版社,1999
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